均相酶免疫法檢測(cè)血清甘膽酸的方法學(xué)評(píng)價(jià)

【摘要】目的：對(duì)均相酶免疫法檢測(cè)血清甘膽酸（CG）進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。方法：用生化分析儀和均相酶免疫法測(cè)定CG，完成精密度、線性分析、回收試驗(yàn)及干擾試驗(yàn)，同時(shí)與放射免疫測(cè)定法進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。結(jié)果：該法批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均<5.0%，在0～60ug/ml范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)方程為Y=1.014X-0.194，r=0.999；平均回收率為95.6%；50g/L血紅蛋白、8.0mmol/L甘油三酯、100.0umol/L膽紅素對(duì)結(jié)果干擾均<5.0%；與放射免疫測(cè)定法結(jié)果比對(duì)，回歸方程為Y=1.030X-0.086, r=0.968，兩者具有高度相關(guān)性。結(jié)論：該法重復(fù)性好，線性范圍寬，抗干擾能力強(qiáng)，與放射免疫分析法檢測(cè)結(jié)果具有高度相關(guān)性，適合在生化分析儀上進(jìn)行自動(dòng)分析。

【關(guān)鍵詞】 甘膽酸 均相酶免疫法 方法學(xué)評(píng)價(jià)

CG是肝臟以膽固醇為原料合成的膽酸再與甘氨酸結(jié)合而成。當(dāng)肝細(xì)胞受損傷、肝占位病變或膽汁淤積時(shí)，可引起CG代謝和循環(huán)紊亂，使血清中的CG量增加，CG測(cè)定廣泛應(yīng)用于肝病及妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的診斷與治療[1-2]。

1． 材料與方法

1.1 試劑與儀器 均相酶免疫法CG試劑、校準(zhǔn)品及質(zhì)控品為安徽伊普諾康生物工程有限公司產(chǎn)品，采用日立7180分析儀完成相關(guān)檢測(cè)。放射免疫法CG試劑為北京原子高科股份有限公司產(chǎn)品，采用CN20放免分析儀完成相關(guān)檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 為住院患者及健康體檢者當(dāng)天采集的血清，共50例，其中異常結(jié)果占25%，所有標(biāo)本無溶血，無脂濁。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 嚴(yán)格按照儀器操作、試劑說明書及實(shí)驗(yàn)室技術(shù)操作規(guī)程進(jìn)行檢測(cè)。CG均相酶免疫試劑的分析參數(shù)：雙波長(zhǎng)340/405nm，試劑與標(biāo)本比20:1，校準(zhǔn)方法為多點(diǎn)定標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2． 結(jié)果

2.1 精密度分析

批內(nèi)精密度：分別測(cè)定三個(gè)不同濃度的CG質(zhì)控品，3h內(nèi)重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算均值、SD及CV。

批間精密度：用三個(gè)不同濃度的CG質(zhì)控品分別測(cè)試3個(gè)不同批號(hào)的試劑，每個(gè)批號(hào)重復(fù)測(cè)試10次，計(jì)算均值、SD、 CV。精密度結(jié)果見附表1

附表1：均相酶免疫法測(cè)定CG的批內(nèi)、批間精密度結(jié)果（ug/ml）

質(zhì)控品濃度	批 內(nèi) x±s CV%		批 間 x ±s CV%
4.00	3.78±0.09	2.43	3.84±0.15	3.92
17.00	17.43±0.16	0.90	17.63±0.37	2.12
40.00	41.63±0.27	0.65	41.62±0.93	2.24

2.2 線性分析（ug/ml）

選取一份接近預(yù)期上限的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定3次，取均值作為理論值，然后用蒸餾水稀釋形成梯度濃度的實(shí)驗(yàn)樣本，將實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算均值。以樣本的理論值為自變量，實(shí)測(cè)值為因變量作線性回歸分析，CG線性分析結(jié)果見附表1。

附表2：CG線性分析結(jié)果（ug/ml）

預(yù)期值	測(cè)定值	相關(guān)性分析
2.50	2.72	Y=1.014X-0.194 r=0.999
5.00	5.26
10.00	9.56
20.00	19.85
40.00	39.62
60.00	61.21

2.3 回收試驗(yàn)

取混合血清標(biāo)本（濃度為2.80ug/ml），分為4份，每份500ul，其中1份加入25ul的生理鹽水，另外3份分別加入濃度為10.0、20.0、40.0、60.0ug/ml的CG標(biāo)準(zhǔn)液25μL，對(duì)每例樣本作雙次測(cè)定，取均值，計(jì)算回收率。CG回收試驗(yàn)結(jié)果見附表3

附表3：CG回收試驗(yàn)結(jié)果（ug/ml）

測(cè)定值	加入濃度	回收率	平均回收率
2.80	/	/	95.6%
3.28	0.48	95.3%
3.75	0.95	96.4%
4.70	1.90	96.0%
5.66	2.86	94.8%

2.4 干擾試驗(yàn)

取混合血清標(biāo)本（濃度為2.80ug/ml），分為4份，每份500ul，其中一份加入100ul生理鹽水,其它三份分別加入100ul的50.0g/L血紅蛋白液、8.0mmol/L甘油三酯、100.0umol/L膽紅素，對(duì)每例樣本作雙次測(cè)定，取均值，計(jì)算偏倚。CG干擾試驗(yàn)結(jié)果見附表4。

附表4：CG干擾試驗(yàn)結(jié)果（ug/ml）

干擾物濃度	測(cè)定結(jié)果	干擾濃度	偏倚%
未加干擾物	2.35	/	/
8.33g/L血紅蛋白	2.40	0.05	2.2%
1.33mmol/L甘油三酯	2.45	0.10	4.3%
16.67umol/L膽紅素	2.42	0.07	3.0%

2.5 比對(duì)試驗(yàn)

選取住院患者及健康體檢者當(dāng)天采集的血清共50例，其中異常結(jié)果占25%。分別用均相酶免疫法試劑和放射免疫法試劑完成CG檢測(cè)。兩種試劑CG檢測(cè)結(jié)果呈高度正相關(guān)（Y=1.030X-0.086, r=0.968）。

3． 討論

1959年Yalow及Berson創(chuàng)建了放射免疫分析法(RIA)，此法應(yīng)用同位素標(biāo)記及特異性高的抗原-抗體反應(yīng)，對(duì)人體內(nèi)的微量物質(zhì)進(jìn)行定量分析，其靈敏度可達(dá)到pg(10-12g)級(jí)水平，但RIA有其無法克服的放射性污染的缺點(diǎn)。1971年Engvall等在RIA原理的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種新的免疫分析方法—酶標(biāo)記免疫分析法（ELISA)，但ELISA操作較繁瑣，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，一般用于定性或半定量分析。1972年Rubenstein及Ullolan，在酶標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)法的基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了均相酶免疫分析方法(EMIT)[3]。

EMIT是利用酶作為標(biāo)記物，在均勻的液相中進(jìn)行的免疫分析技術(shù)。與其它用酶為標(biāo)記物的免疫方法不同，EMIT不需要分離抗原抗體復(fù)合物，整個(gè)反應(yīng)過程在均一的液相中進(jìn)行，沒有酶量的變化，以酶活性的高低作為檢測(cè)的指標(biāo)，這樣就能夠達(dá)到快速與簡(jiǎn)便的要求[4]。

CG檢測(cè)方法有放射免疫分析法、膠乳免疫比濁法和均相酶免疫比色法。放射免疫分析法因?yàn)閲?guó)家對(duì)同位素的嚴(yán)格管制以及放射性污染而逐漸被淘汰。膠乳免疫比濁法用于生化分析儀的自動(dòng)化分析，具有靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，但膠乳顆粒具有較強(qiáng)的粘附性，容易污染比色杯并造成交叉污染。而均相酶免疫比色法不但具有膠乳免疫比濁法的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)克服了其污染比色杯的弊端，為CG的自動(dòng)化分析開辟了一條新的途徑，具有良好的發(fā)展前景。

EMIT法檢測(cè)CG原理：游離甘膽酸與葡萄-6-磷酸脫氫酶—甘膽酸偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抗甘膽酸特異性抗體位點(diǎn)，樣本中游離甘膽酸越多，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體位點(diǎn)越多，抗體釋放出的酶標(biāo)偶聯(lián)物就越多。游離出來的甘膽酸酶標(biāo)偶聯(lián)物催化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(NAD﹢)轉(zhuǎn)化為β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原型(NADH)。樣本中甘膽酸濃度與NADH生成量成正比，通過檢測(cè)340 nm波長(zhǎng)的吸光度變化即可計(jì)算出甘膽酸含量[5]。

安徽伊普諾康生物工程有限公司生產(chǎn)的甘膽酸均相酶免疫法試劑盒，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、重復(fù)性佳、抗干擾能力強(qiáng)、線性范圍寬等特點(diǎn)，與放射免疫分析法的檢測(cè)結(jié)果有高度相關(guān)性。與放射免疫分析法和膠乳免疫比濁法相比，具有相當(dāng)?shù)姆磻?yīng)靈敏度，同時(shí)克服了同位素的放射性污染和膠乳顆粒污染比色杯的弊端，是適合在生化分析儀上進(jìn)行自動(dòng)分析的理想生化試劑。

參 考 文 獻(xiàn)

1．楊禮彬．甘膽酸檢測(cè)的臨床應(yīng)用．分析免疫與臨床[J]，1999，6（6）：116-117．

2．張銘，左偉，周洪興．清甘膽酸的測(cè)定在妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥中的診斷意義及與胎兒預(yù)后關(guān)系．中國(guó)婦幼保健[J]，2005，20（19）：2521-2522.

3．陶涵．均相酶免疫分析簡(jiǎn)述．藥學(xué)通報(bào)[J]，1987，12（22）：745-747．

4．劉奉亭．均相酶技術(shù)進(jìn)展．國(guó)外醫(yī)學(xué)生物檢驗(yàn)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)[J]，1989，6（10）：11-13．

5．甘膽酸試劑盒使用說明書．安徽伊普諾康生物工程有限公司．